DIG RNA标记混合物

一般描述

标记效率：来自1μg 线性模板DNA的约10μg的全长地高辛标记RNA被转录。
检测时间：135分钟
样本材料
线性化质粒DNA：
待转录的DNA将会被克隆至含有SP6，T7或T3 RNA聚合酶启动子并相邻于多接头的合适转录载体的多接头位点。对于“流失”转录本的合成，质粒是通过限制性酶进行线性化的。限制性酶生成的5′-突出应当被使用；3′ 突出应当被避免。线性化的模板DNA应当通过酚氯仿抽提及乙醇沉淀进行纯化，以避免RNase的污染。对于′run around′转录环状质粒DNA会被使用。
PCR产物：
含有RNA聚合酶启动子序列的PCR片段也可被用作转录的模板。推荐在转录之前对PCR片段使用HIghPure柱进行纯化。

通过这种方法，特定长度的DIG标记单链RNA探针通过体外转录被生成。在标准条件下，DIG-11-UTP通过SP6、T7和T3 RNA聚合酶以大约每20到25个核苷酸的间隔插入转录产物中。DIG RNA标记混合物专门设计用于优化转录缓冲液的SP6, T7和T3 RNA聚合酶。
便捷的核苷酸混合物用于基于地高辛-11-UTP的RNA标记

内含物
10x 溶液带有：10 mM ATP, CTP, GTP (各), 6.5 mM UTP, 3.5 mM DIG-11-UTP.

特异性

热灭活：添加 2 μl 0.2 M EDTA (pH 8.0) 终止反应。

应用

利用SP6，T7及T3 RNA聚合酶通过体外转录而使用地高辛-11-UTP进行RNA标记。DIG标记RNA已用于多种杂交技术：

Northern blots

Southern blots

斑点印迹

菌斑或克隆提升

RNase保护实验

染色体, 细胞, 及组织切片原位